一、消化與吹打
版上很多朋友討論細(xì)胞培養(yǎng)問題，見到很多很好的經(jīng)驗總結(jié)，這里說一些我個人的經(jīng)驗，因為一些比較特殊的原因，我自己培養(yǎng)接觸過近300種細(xì)胞，常用于做實驗的，累積有百余種，可以說遇到過許多各式各樣古怪的細(xì)胞。這里挑細(xì)胞消化開始做我的**篇專題，并不是因為細(xì)胞消化**重要，而是近期看到大家頻繁討論這個話題，我就拋磚引玉，下面幾點拙見，可能與其它朋友總結(jié)的一些經(jīng)驗有點出入，僅供大家參考。
許多同學(xué)對細(xì)胞消化做了許多研究，得出了很多有價值的經(jīng)驗，也見到很多人的困惑。其實細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是細(xì)胞系的培養(yǎng)，就消化而言，不是太難，做得多了，善于總結(jié)經(jīng)驗，就能把細(xì)胞越養(yǎng)越好。一般的程序步驟，細(xì)節(jié)操作，我這里就不講了，只講一些基本操作背后的知識，如果不對之處，歡迎指正，一起討論：
1，其實jue大部分細(xì)胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可，吸去胰酶后，殘留的那些無法計算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細(xì)胞（jue大部分1min不到）。對于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代，對細(xì)胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37度消化。
2，什么算是消化好了呢？不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動了，多半呈沙壯移動，其實已經(jīng)可以了，很多人喜歡把細(xì)胞消化或者吹打成完全分離細(xì)胞，這是沒有必要的。一般能移動了，說明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個時候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。細(xì)胞就是完全成單個細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個特性，無論死活的細(xì)胞都是如此，你可以嘗試，準(zhǔn)備100%的單個細(xì)胞懸液，貼壁后觀察細(xì)胞，仍然是幾個幾個細(xì)胞聚集在一起。一些懸浮培養(yǎng)細(xì)胞也是如此，容易聚集，不要去嘗試過幾個小時就拿出來吹打成單細(xì)胞懸液（不要笑，這個是初養(yǎng)懸浮細(xì)胞的人常犯的錯誤，以為懸浮培養(yǎng)就是一個一個分開）。細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，這個時候即使是成片的（比如Calu-3細(xì)胞），吹打不超過20次后（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個細(xì)胞左右），是正常的，不要試圖再去延長消化時間，或者象有的同學(xué)那樣吹打1h，等待單細(xì)胞懸液出現(xiàn)。
3，另一個帖子里提到一個比較復(fù)雜的四步消化法，這個挺有意思，我也是**次聽說，應(yīng)該是網(wǎng)友自己發(fā)展出來的方法，很有參考價值。但我估計這個方法可能對付少數(shù)非常怪異的細(xì)胞才需要這么復(fù)雜的程序。我目前養(yǎng)過的近300株細(xì)胞里面，還沒遇到這么怪異的。比如Caco2其實是很好消化的細(xì)胞，不需要胰酶孵育即可，只是有點成片分布。不要以為成片分布是自己沒養(yǎng)好，這個視細(xì)胞而定。如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致，那可能是自己沒消化好導(dǎo)致的，但如果消化方法正確，仍然成片分布，甚**完全吹打成單細(xì)胞懸液，貼壁后仍然成片分布，這是細(xì)胞的特性，是因為貼壁過程中重新聚集了。這個時候你拼了命要去讓它均勻分布，你的細(xì)胞之后會對你越來越不好。
4，比較難消化的細(xì)胞（潤洗方法5min還不能消化），就以colon cancer為例，比如HCT15, LS411和KM12，這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100 mm dish，一次**多加入500ul，就足夠了，一般我加300ul。即使這樣難消化的細(xì)胞，一般不超過5min，即可見細(xì)胞成片移動，就應(yīng)該停止消化。一些正常細(xì)胞也會有難消化的時候，比如tsDC細(xì)胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動。
5，常規(guī)的細(xì)胞實驗（增殖，凋亡，遷移，分化之類的），受消化影響不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話（難消化細(xì)胞例外）。但少數(shù)實驗，比如病毒包裝，對細(xì)胞代數(shù)，對細(xì)胞狀態(tài)要求極高。這個時候，胰酶消化，就是潤洗，都會對細(xì)胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細(xì)胞包裝能力就會逐漸下降（當(dāng)然也有其它因素影響包裝效率）。這個時候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關(guān)酶的活性，來使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。
6，EDTA的作用。許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用trypsin/EDTA聯(lián)合作用。這里要明白，trypsin切割ECM的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者對付特別難消化的細(xì)胞，添加多一些EDTA，就是這個道理。一般不要試圖延長消化時間（如果10min還消化不徹底的話），而應(yīng)該想其它辦法。
7，PBS洗滌。消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因為Serum含有抑制trypsin的蛋白。但這里面也有學(xué)問可以講，對于一些難消化細(xì)胞，那么可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因為這些離子也會抑制trypsin的活性。但對于jue大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細(xì)胞，不需要配制如此溶液。
總結(jié)下來，雖然這個帖子是關(guān)于消化的，但其實消化并不是細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵所在（雖然很重要），關(guān)鍵所在是#p#分頁標(biāo)題#e#細(xì)胞來源，血清質(zhì)量和水源（自己配制溶液的話）。我看到版上許多人養(yǎng)細(xì)胞遇到各種各樣的問題，很多時候bottleneck沒有找到，雖然通過其它方法有所改善，但仍然是事倍功半。因為人們往往注意自己的操作，總覺得自己沒有經(jīng)驗，而忽視試劑，溶液尤其是細(xì)胞的質(zhì)量，后者其實才是許多細(xì)胞培養(yǎng)實驗室常見的問題。
從**基礎(chǔ)的地方教起，一步一步詳細(xì)介紹細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，非常好的開門教程
常用設(shè)備
準(zhǔn)備室的設(shè)備：單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品）、儲品柜（放置消毒過的物品）、包裝臺。
配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。
培養(yǎng)室的設(shè)備：液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80℃）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。
必須放在無菌間的設(shè)備：離心機（收集細(xì)胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO₂孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4℃冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。
無菌操作
無菌室的滅菌：
定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5％過氧乙酸擦拭。
CO₂孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射
實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘
實驗后滅菌：用75％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。
實驗人員的無菌準(zhǔn)備：
肥皂洗手。
穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋
用75％酒精棉球擦凈雙手。
無菌操作的演示：
凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
靠近酒精燈火焰操作。
器皿使用前必須過火滅菌
繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。
各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。
吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。
器械的清洗和消毒
玻璃器械洗消：
一、新的玻璃器皿的洗消：
自來水刷洗，除去灰塵。
烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。
刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。
泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗15次，**后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。
烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。
高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，當(dāng)蒸氣成直線上升時，關(guān)閉安全閥，當(dāng)指針指向15磅時，維持20-30分鐘。
高壓消毒后烘干
二、舊的玻璃器皿的洗消：
刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。
泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。
烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。
高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當(dāng)蒸氣成直線冒出#p#分頁標(biāo)題#e#3-5分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓表指數(shù)隨之上升，當(dāng)指針指向15磅時，調(diào)節(jié)電開關(guān)維持20-30分鐘即可。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）
烘干備用：因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。
金屬器械洗消：
金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75％酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。
橡膠和塑料：
橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進行如下的處理程序：
針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小時,或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺內(nèi)取出使用時應(yīng)該立即將螺旋旋緊。
膠塞烘干后用2％氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。**后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。
膠帽，離心管帽烘干后只能在2％氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。**后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。
膠頭可用75％酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。
塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：
其他消毒方法：
有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周時間洗除殘留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射線消毒塑料制品效果**好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標(biāo)記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時__這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆(CoC₁₂•6H₂O)2g，30％鹽酸10m1，蒸餾水88m1。
注意事項：
嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時燒干，水不能過多因為其將使空氣流暢受阻，會降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。
安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。
注意人體的防護和器皿的完全浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時防止酸液濺到地面，會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。
細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒
器材與試劑：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計、磁力攪拌器。
具體步驟：
一. 水的制備：
細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水
二.PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：
1.溶解定容：將藥品（NaCl：8.0g，KCl：0.2g，Na_{2#p#分頁標(biāo)題#e#}HPO₄•H₂O：1.56g，KH₂PO₄：0. 2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容**1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。
2.移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發(fā)掉的水份。
三. 胰蛋白酶溶液的配制與消毒：
胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力**強。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca²⁺、Mg²⁺和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca²⁺、Mg²⁺的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。
1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過夜。
2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。
四.青、鏈霉素溶液的配制于消毒
1. 所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。
2.具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。
3.使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度**終為100單位/ml。1單位＝1微克？
五.RPMI1640的制備與消毒：
1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢?*粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度**終各為100單位/ml。然后用一個當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。**后定容**1000ml，搖勻。
2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。
3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。
4.分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。
5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時兩周有效）。
六．血清的滅火：
細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。#p#分頁標(biāo)題#e#
七.HEPES溶液：
HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。
1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：
準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容**1L。過濾除菌，分裝后4℃保存。
注意：因為現(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。
八.谷氨酰胺：
合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚**死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應(yīng)單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加**100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
九.肝素溶液的配制：
含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中**終濃度為50ug/ml。因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為℃
使用時，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。
十. Ⅰ型膠原酶：
0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。
十一.明膠溶液：
因為明膠難于過濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。shou要的問題是如何無菌準(zhǔn)確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中， 4℃保存。
其他培養(yǎng)用液的配制：
20ug/ml內(nèi)皮生長因子，
注意事項：
1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。
2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。
3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH#p#分頁標(biāo)題#e#值**終為7.2，可在配制時調(diào)PH**7.4。
細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法）
具體操作：
一. 傳代前準(zhǔn)備：
1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。
2.用75％酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。
3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。
4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。
5.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。
6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。
7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細(xì)胞。
8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。
二.胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞**好，**佳消化溫度是37℃。
2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時細(xì)胞消化適度。
3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。
三、吹打分散細(xì)胞：
1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。
2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。
3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。
4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。
四.分裝稀釋細(xì)胞：
1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝**2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。
2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×10⁵/ml。**后要做好標(biāo)記。
五.繼續(xù)培養(yǎng)：
用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。
傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項：
1.嚴(yán)格的無菌操作
2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH₂PO₄ 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容**1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時細(xì)胞容易脫壁。
細(xì)胞的復(fù)蘇
細(xì)胞復(fù)蘇的原則－快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化**37℃，使細(xì)胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。#p#分頁標(biāo)題#e#
具體操作
一. 實驗前準(zhǔn)備：
1.將水浴鍋預(yù)熱**37℃
2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。
二．取出凍存管：
1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。
2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時核對管外的編號。
三．迅速解凍：
1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。
四.平衡離心：
用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min
五.制備細(xì)胞懸液：
1.吸棄上清液。
2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。
六.細(xì)胞計數(shù)：
細(xì)胞濃度以5×10⁵/ml為宜。
七.培養(yǎng)細(xì)胞
將復(fù)合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細(xì)胞情況而定。
初學(xué)者易犯錯誤：
1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。
2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時間延長。
3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機損壞和細(xì)胞丟失。
4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。
細(xì)胞計數(shù)
實驗原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。
具體操作：
一.準(zhǔn)備工作：
取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以被使用。
二.細(xì)胞懸液制備：
細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細(xì)胞懸液。
三.細(xì)胞計數(shù)：
1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上。
2.制備計數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍(lán)染液（0.4％）或苯胺黑，活細(xì)胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。
3.將細(xì)胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。
4.統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。
5.計算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計算細(xì)胞密度：
（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝ （ 四個大格子細(xì)胞數(shù)/4) ×2×10⁴
說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。
公式中乘以2因為細(xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。
公式中乘以10⁴因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：
1.0mm（長）#p#分頁標(biāo)題#e#×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm³ 而 1ml＝1000mm³
四.細(xì)胞計數(shù)要點：
1.進行細(xì)胞計數(shù)時，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于10⁴個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；
2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計數(shù)準(zhǔn)確性。
3.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準(zhǔn)確；
4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團時，只按照一個細(xì)胞計算。如果細(xì)胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。
5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。
五.初學(xué)者易犯的錯誤：
1. 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。
2. 滴入細(xì)胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。
3. 滴入懸液時的量太多，**使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。
六.本實驗特殊試劑的配制：
4％臺盼藍(lán)母液：稱取4克臺盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水**100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。
使用液：使用時，用PBS稀釋母液**0.4％即可。
細(xì)胞的凍存
1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。
2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。
3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。
4.置于液氮罐中長期保存。
5同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。
注意事項：
1.使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結(jié)構(gòu)，以**于降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時**好戴上手套操作。
2.不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險溫區(qū)”。
3.注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時添加。
細(xì)胞培養(yǎng)三不要
養(yǎng)細(xì)胞是醫(yī)學(xué)研究生的基本功。我養(yǎng)過骨髓MSC、心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、AD293腺病毒包裝細(xì)胞、PA317逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞。養(yǎng)得**多的是MSC。有三個小經(jīng)驗和大家分享一下：
1. 不要燒瓶口。大多數(shù)人都喜歡在酒精燈的火焰上關(guān)瓶子，覺得這樣可以避免污染。不知道大家是不是有培養(yǎng)基怎么越用越發(fā)紫的困惑？知道為什么嗎？燒瓶口燒的。培養(yǎng)基一般都是用碳酸/碳酸氫跟作緩沖體系。瓶口在火焰上的時候，熾熱的空氣進入瓶內(nèi)。塞緊塞子放入冰箱后，空氣變冷，壓力驟降，培養(yǎng)基中的碳酸就會轉(zhuǎn)化成二氧化碳，釋放出來。培養(yǎng)基中的碳酸少了，當(dāng)然會變堿。如果不燒瓶口的話，你會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變堿的速度會大大減慢。（當(dāng)然多多少少還是會有一點越用越堿，因為室溫還是比冰箱內(nèi)的溫度高）
其實燒瓶口防止污染純粹是心理安慰。不妨試一下把手指在火上晃幾下，你會發(fā)現(xiàn)根本就不會燒疼。如果有細(xì)菌的話，這么晃兩下也燒不死多少。要想燒死全部細(xì)菌，除非把瓶口和塞子燒紅。我在G內(nèi)從來就不燒瓶口。來美G以后發(fā)現(xiàn)這里更徹底，超凈臺內(nèi)根本就不點酒精燈。
2. 不要頻繁看細(xì)胞。對于初學(xué)者而言，養(yǎng)細(xì)胞就像養(yǎng)孩子一樣，有空就要去看看。細(xì)胞越是養(yǎng)不好，就越是經(jīng)常去看。實際上看細(xì)胞對細(xì)胞的生長沒有任何好處，特別是對原代細(xì)胞或是免疫磁珠分選后，密度特別低的細(xì)胞。培養(yǎng)基中的生長因子是非常有限的。細(xì)胞好不容易自分泌一點兒促生長的因子在其周圍，形成有利于生長的局部環(huán)境。你跑去看細(xì)胞，培養(yǎng)瓶這么一晃，把因子都給晃散了。經(jīng)常可以看到新手**到晚都在看細(xì)胞，細(xì)胞老是長不好。老手細(xì)胞一扔好幾天不管，細(xì)胞瘋長。#p#分頁標(biāo)題#e#
3. 不要怕消化。在傳代的時候，初學(xué)者往往生怕細(xì)胞消化過度，早早地終止消化。細(xì)胞沒下來就使勁吹燈，吹得滿瓶子都是氣泡。在我看來，用力吹打?qū)?xì)胞的損傷比消化更大。我?guī)熜衷谧鲅芷交≡臅r候，37度消化過夜，細(xì)胞也沒事。我一般是等細(xì)胞完全變圓后才中止消化。細(xì)胞輕輕一晃就能下來。還有，動作要輕柔，盡量不要產(chǎn)生氣泡。氣泡在破裂時的機械應(yīng)力相當(dāng)大，對細(xì)胞的傷害也是很大的。 
原代培養(yǎng)技術(shù)
一、組織塊直接培養(yǎng)法
1、取材，用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。
2、用手術(shù)剪將組織剪切成1mm³ 左右的小塊，再用Hank's液洗三次。
3、將組織塊轉(zhuǎn)移**培養(yǎng)瓶，并貼附于瓶底面。
4、輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，瓶底朝上，向瓶內(nèi)注入適量的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶放置在37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
5、放置待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。二、消化培養(yǎng)法
1、取材，用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。
2、用手術(shù)剪將組織剪切成1mm³ 左右的小塊，再用Hank's液洗三次。
3、視組織塊量加入酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。
4、加入3—5ml培養(yǎng)液以終止酶消化作用（或加入相關(guān)酶抑制劑）。
5、靜置5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
6、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。
7、加入Hank's液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。
8、加入培養(yǎng)液1—2ml（視細(xì)胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。
9、將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。
三、 器官培養(yǎng)
1、將不銹網(wǎng)做成支架形狀，調(diào)整其高度**培養(yǎng)皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔徑濾膜。
2、將培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿中，使液面剛剛接觸到濾膜，但不要使其浮起。
3、將要培養(yǎng)器官組織放在濾膜上，一般厚度不要超過200μm，水平面積不超過10mm² 。
4、將上述準(zhǔn)備好的培養(yǎng)物放入CO₂ 培養(yǎng)箱，并加注氧氣調(diào)整氧分壓，**好到90%。
5、培養(yǎng)過程中要注意觀察培養(yǎng)液平面，盡可能保持在與濾膜一致的水平上。
6、上述可進行器官培養(yǎng)1-3周，每2-3天換液一次，并根據(jù)情況做進一步實驗和檢測。
胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)：從技巧走向科技
實驗室培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞是個不小的壯舉，培養(yǎng)的講究，易溶細(xì)胞勞動密集型，在一定程度上與其說是精密科學(xué)不如說是技巧。
然而，現(xiàn)在，威斯康星大學(xué)麥迪遜分校（the University of Wisconsin-Madison）一研究小組報告，研制了一個完全確定的培養(yǎng)體系，為細(xì)胞治療提供更均一更安全產(chǎn)品
The journal Nature Methods Nov.14上報道，該小組由Laura Kiessling*導(dǎo)，一位威斯康星大學(xué)麥迪遜分校化學(xué)教授，介紹了一種廉價的、能（適應(yīng)）所有細(xì)胞的（培養(yǎng)）系統(tǒng)，從而免受培養(yǎng)（操作過程中）的不確定性工作（或因素的影響）。
“這是一項很簡單的技術(shù)，任何人都能使用” Kiessling說。
目前，人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的大多是用于研究，然而，隨著時間推移培養(yǎng)系統(tǒng)會改進，科學(xué)家們?nèi)杂檬笤醇?xì)胞及蛋白的支持干細(xì)胞生長的“表面”培養(yǎng)人類細(xì)胞，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞。如此會增加病原體，如病毒，如果培養(yǎng)的干細(xì)胞用于人體治療，這是一個嚴(yán)肅的問題（涉及生物安全）。
新的培養(yǎng)系統(tǒng)利用一種人工合成的化學(xué)方法制成蛋白片段及多肽基質(zhì)，對干細(xì)胞有親和作用。結(jié)合界定的培養(yǎng)基，由威斯康星團隊設(shè)計的培養(yǎng)系統(tǒng)可以讓細(xì)胞處在未分化狀態(tài)保持3個月或更長。根據(jù)新的報告，該系統(tǒng)也適用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，成人細(xì)胞經(jīng)過遺傳學(xué)重編類似于胚胎干細(xì)胞。
Kiessling表示，在該系統(tǒng)，細(xì)胞經(jīng)常被檢測是否分化為所需的細(xì)胞類型，在一定時間內(nèi)與市售有效的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對比看是否達(dá)到一致。
Kiessling表示，**人類胚胎干細(xì)胞臨床試驗在進行中，正在啟動人類患者更多試驗，相信在安全性問題上是**高**上的。
Kiessling解釋，目前通常使用的培養(yǎng)系統(tǒng)是不確定性，并沒有真正知道細(xì)胞是否接觸，且無均一性，代與代之間是否存在變異。而我們研發(fā)的系統(tǒng)是確定的并且是廉價的。#p#分頁標(biāo)題#e#
Kiessling的研究小組的工作得到了美GG立衛(wèi)生研究院和威斯康星材料科學(xué)與工程研究中心大學(xué)的支持。
細(xì)胞培養(yǎng)中的污染分為兩類，化學(xué)污染和生物污染。
化學(xué)污染
化學(xué)污染是一些對細(xì)胞有毒性的或?qū)?xì)胞產(chǎn)生刺激的化學(xué)物質(zhì)。這些污染一般來自于沒有洗凈的器皿、不純的化學(xué)試劑和質(zhì)量較差的蒸餾水等。
化學(xué)污染中比較引人注意的是細(xì)菌內(nèi)毒素。它是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞死亡后解體釋放出的疏水性的細(xì)胞壁組成物質(zhì)，對塑料等疏水性強的物質(zhì)有很強的吸附能力。細(xì)菌內(nèi)毒素可刺激部分細(xì)胞產(chǎn)生一些激素或細(xì)胞因子，對細(xì)胞生長和實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。細(xì)菌內(nèi)毒素是臨床上的**主要的熱原（即注射到動物體內(nèi)會導(dǎo)致動物發(fā)熱），所以通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗、細(xì)胞因子等用在臨床上的藥品的生產(chǎn)過程中更是要避免細(xì)菌內(nèi)毒素的污染。
生物污染
生物污染包括比較容易發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、霉菌和酵母的污染，和較難發(fā)現(xiàn)的病毒、支原體和其他細(xì)胞的污染。
細(xì)菌、霉菌和酵母到處存在，它們能在合適的環(huán)境中非常快速的生長。這些污染比較容易觀察到，它們往往會使其污染的培養(yǎng)液產(chǎn)生可見的變化，或者通過顯微鏡觀察就可以看見。
由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現(xiàn)，因為病毒顆粒特別微小，一般的實驗室都沒能力檢查細(xì)胞培養(yǎng)中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細(xì)胞內(nèi)，對整個細(xì)胞培養(yǎng)不是致死的，所以它可能會使研究人員長期得到受病毒影響的細(xì)胞的實驗結(jié)果。
1956 年 Robinson 及其同事**發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染。90年代初美G的一個調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在該G的細(xì)胞培養(yǎng)中，**少有15%被支原體污染。由于支原體沒有細(xì)胞壁，在細(xì)胞培養(yǎng)液中幾乎是透明的，同時對常用于細(xì)胞培養(yǎng)中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養(yǎng)液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現(xiàn)，但是其存在會影響實驗的結(jié)果。
細(xì)胞的交叉污染在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生的嚴(yán)重程度大大超過人們的想象：1981 年對ATCC細(xì)胞株的調(diào)查顯示：超過 60 標(biāo)記為其他細(xì)胞株的細(xì)胞居然是 HeLa 細(xì)胞。
細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)節(jié)問題
1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進行下一個細(xì)胞株之操作。
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(**少Class II)。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目： 5.1. CO₂ 鋼瓶之CO₂ 壓力 5.2. CO₂ 培養(yǎng)箱之CO₂ 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。
基礎(chǔ)篇-實驗用品
1. 種類︰
1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。
1.2. TC 級培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask，plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene (PP) 為不透明材質(zhì)，polystyrene (PS) 為透明材質(zhì)，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml#p#分頁標(biāo)題#e#
2. 清洗︰
2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用。
2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌︰
3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。
3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170℃, 4 小時。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 ℃, 15 lb, 20 分鐘處理。
基礎(chǔ)篇-培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4℃ 冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃ 水槽中溫?zé)帷?/strong>
2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細(xì)胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例)： 3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO₃ 為另外添加，若將NaHCO₃ 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO₃ 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO₂ 氣體調(diào)整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細(xì)胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。
3.2. 材料： 純水(milli-Q 水或二次**三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要) ，粉末培養(yǎng)基 ，NaHCO₃  ，電磁攪拌器 無菌血清瓶 ，0.1 或0.2 mm無菌過濾膜 ，pH 計，真空泵，CO₂ 氣體
3.3. 步驟：
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO₃ 粉末溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO₂ 氣體**飽和，約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO₂ 之NaHCO₃ 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。混后溶液之pH 應(yīng)為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO₂ 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝**無菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4℃。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。
附-配制培養(yǎng)基之生長測試
材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
步驟：
1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細(xì)胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每個well 接種1 × 10² 活細(xì)胞，同時作對照組實驗。
2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。
3. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。
4. 去除固定液，水洗二次。
5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
6. 去除染液，水洗二次。
7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細(xì)胞生長不佳，則丟棄之。
基礎(chǔ)篇-抗生素
1. 細(xì)胞庫之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素 1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。 1.2. 培養(yǎng)自其它實驗室引進之細(xì)胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze 通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。
2. 寄送活細(xì)胞時，須將培養(yǎng)液充滿整個flask 時，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
3. 若要檢測mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會抑制mycoplasma 生長。
4. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強。
5. 抗生素使用種類與濃度：

抗生素	工作濃度	儲存溫度	殺滅細(xì)菌
penicillin(青霉素)	100 units/ml	-20℃	G(+) bacteria
streptomycin(鏈霉素)	100 ug/ml	-20℃	G(+) and G(-) bacteria
amphotericin B(潮霉素B)	2.5 ug/ml	-20℃	yeast and molds
fungizone	2.5ug/ml	-20℃	yeast and molds
Chlotetracycline(金霉素)	50 ug/ml	-20℃	G(+) and G(-) bacteria
gentamicin(慶大霉素)	50 ug/ml	-20℃	G(+) and G(-) bacteria
nystatin(制霉菌素)	50 ug/ml	-20℃	yeast and molds
amphotericin B(潮霉素B)	2.5 ug/ml	-20℃	yeast and molds

#p#分頁標(biāo)題#e#基礎(chǔ)篇-血清
1. 血清必須貯存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。如果一次無法用完一 瓶，可將40～45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時體積會增加約10 %， 必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。
2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。
3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20℃或–70℃**4℃冰箱溶解**，**室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接**37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。
4. heat-inactivation 是指56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沈淀物之顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。補體參與之反應(yīng)有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。
5. 勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。
6. 血清之沈淀物
6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜。
6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點應(yīng)不會影響細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號的血清。
附-血清之生長測試
材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 6-well TC plate (or 35mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)
步驟：
1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測試過) 培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞于T75 flask **80% confluency。
2. 以trypsin-EDTA 處理細(xì)胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM 制成細(xì)胞懸浮液，并測細(xì)胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM 稀釋細(xì)胞濃度為1×102活細(xì)胞數(shù)/ ml。
3. 將1 ml 細(xì)胞懸浮液接種入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a(chǎn)-MEM，使血清**終濃度為10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。
4. 37 oC，5 % CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。
5. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。
6. 去除固定液，水洗二次。
7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
8. 去除染液，水洗二次。
9. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)
10. 計算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
11. 計算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測血清對細(xì)胞生長的影響。訂購多量同一批號的優(yōu)良血清，置于–70℃ 保存之
基礎(chǔ)篇-細(xì)胞傳代培養(yǎng)
1. 細(xì)胞生長**高密度時，即須分殖**新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 **1:6，依細(xì)胞種類而異。
2. 材料：
2.1. 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃#p#分頁標(biāo)題#e# 水槽回溫。
2.3. 新鮮培養(yǎng)基
2.4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶
3. 步驟：
3.1. 附著型胞(adherent cell)
3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。
3.1.2. 用D-PBS 洗滌細(xì)胞一**二次。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm², 2ml/75cm²)，37 ℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。)
3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移**新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.2. 懸浮型細(xì)胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。
3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移**新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.3. 融合瘤(hybridoma)
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖**新培養(yǎng)瓶中。
基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保存 （一）
1. 注意事項：
1.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài)，約為80 – 90 ％致密度。
1.2. 冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一**二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
1.3. 注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micronFGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。
1.4. 冷凍保存之細(xì)胞濃度：
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 10⁶ cells/ml
1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后死去。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 10⁶，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10⁶cells/ml。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 10⁶cells/ml, human lymphocyte 須**少5 x 10⁶cells/ml。
1.5. 冷凍保護劑濃度為5 或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗。
1.6. 冷凍方法：
1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4℃ 10 分鐘---> -20℃ 30 分鐘---> -80℃ 16 - 18 小時(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長期儲存。
1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機以–1 ～ -3℃/分鐘之速度由室溫降**–120℃，放在液氮槽vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。
基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保存 （二）
2. 材料：
2.1. 生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞
2.2. 新鮮培養(yǎng)基
2.3. DMSO (Sigma D-2650)
2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5. 0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6. 血球計數(shù)盤與蓋玻片
2.7. 等速降溫機(KRYO 10 Series II)
3. 步驟：
3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。
3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，**后濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。
3.3. 依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 10⁶ cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。
3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16～18 小時(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲存。
3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。程序為: program 7: HB CELL
基礎(chǔ)篇-冷凍細(xì)胞活化#p#分頁標(biāo)題#e#
1. 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。
2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一**二代，其細(xì)胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
3. 材料 37℃ 恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶，液氮或干冰容器
4. 步驟：
4.1 操作人員應(yīng)戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。
4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。
4.4 取出冷凍管，立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。
4.5 取出0.9 ml 解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例1:10～1:15)，混合均勻，放入CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。
4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO 或glycerol)，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
4.7 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式 (一)
1. 收到細(xì)胞株包裹時， 請檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細(xì)胞株請盡速開始培養(yǎng)， 或立即冷凍保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到液氮)。
2. 冷凍細(xì)胞解凍程序:
2.1. 依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。jue大多數(shù)之細(xì)胞均無法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類， 若因?qū)嶒炐枰?必須有所不同時， 務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成， 確定細(xì)胞適應(yīng)后， 方進行所需之實驗。
2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細(xì)胞而言差異極大，請務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。
2.3. 將培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫， 回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管， 立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內(nèi)。
2.4. 依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無菌操作臺內(nèi)取10 ml 培養(yǎng)基加**T25 或T75 flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基， 混合均勻，放入37 °C，5 % CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
2.5. 對jue大多數(shù)細(xì)胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除， 待第二天確定細(xì)胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數(shù)因?qū)MSO 敏感或會造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中，離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后， 轉(zhuǎn)移**培養(yǎng)瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO₂ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式 (二)
收到T25 flask 細(xì)胞時， 處理方式為︰
1. 于寄送過程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細(xì)胞實驗室。
2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO₂ 培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫**37 °C， 并讓運送過程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長滿盤， 則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。
附-細(xì)胞計數(shù)與存活測試（一）
1. 原理：
1.1. 計算細(xì)胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coulter counter 粒子計數(shù)器自動計數(shù)。
1.2. 血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber 中細(xì)刻9 個1 mm2 大正方形，其中4 個角落之正方形再細(xì)刻16 個小格，深度均為0.1 mm。當(dāng)chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1 mm² x 0.1 mm=1.0 x 10^-4 ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細(xì)胞數(shù)目。
1.3. 存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue 染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。 #p#分頁標(biāo)題#e#
附-細(xì)胞計數(shù)與存活測試（二）
3.4. 若不用血球計數(shù)盤，可用Coulter counter 作自動計數(shù)，惟無法辨別死細(xì)胞或活細(xì)胞。
3.5. 范例： T75 monolayer culture 制成10ml 細(xì)胞懸浮液，取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan  blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。 活細(xì)胞數(shù)/方格：55 ,62, 49, 59 死細(xì)胞數(shù)/方格：5, 3, 4, 6 細(xì)胞總數(shù)= 243 平均細(xì)胞數(shù)/方格= 60.75 稀釋倍數(shù)= 2 細(xì)胞數(shù)/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 細(xì)胞數(shù)/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：225/243﹦92.6 %
升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)1
1 冷凍管應(yīng)如何解凍？ 取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。
2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細(xì)胞外， jue大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。
3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無法存活。
4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源， 所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。
升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)2
5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
6 培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5 % 或10% CO₂？或根本沒有影響？ 一般培養(yǎng)基中大都使用HCO₃^-/CO₃^2-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO₃ 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO₂ 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO₃ 含量為每公升3.7 g 時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10 % CO₂；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO₃ 為每公升1.5 g 時， 則應(yīng)使用5 % CO₂ 培養(yǎng)細(xì)胞。
7 何時須更換培養(yǎng)基？ 視細(xì)胞生長密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。
8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
9 附著性細(xì)胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？ 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。**次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 °C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。
10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？ 一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液**另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋**適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。
升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)3
11 欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？ 欲回收動物細(xì)胞， 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。
12 細(xì)胞之接種密度為何？
      依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。
13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？ 動物細(xì)胞冷凍保存時**常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完成。
14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？ 冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況， **次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。
15 冷凍保存細(xì)胞之方法？ 冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C **–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。#p#分頁標(biāo)題#e#
升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)4
16 細(xì)胞欲冷凍保存時， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x10⁶ cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x10⁶ cells/ml vial 為宜。
17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？
 細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之**好方法。
18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理？ 加入相應(yīng)抗生素。直接滅菌后丟棄之。
19 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經(jīng)驗之**外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。
20 支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？ 支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
21 偵測出細(xì)胞株有支原體污染時， 該如何處理？ 直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。
22 CO₂ 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？ 定期(**少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)5
23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？ 培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO₂ 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO₂， 以調(diào)整pH 值。
24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？ 不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。
25 購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？ 研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
26 購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？ 研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細(xì)胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細(xì)胞置于–80 °C 太久。
27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？ 冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊
升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)6
28 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？ 培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，**MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)**好**AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。
29 L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有**終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。
30 GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？ GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有**小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。
31 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)7
32 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。#p#分頁標(biāo)題#e#
33二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？ 二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。
34目錄上說，Hank‘s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO₂培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle‘s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？ HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO₂平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO₂中，溶液會變堿，Hanks液在CO₂培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO₂培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。
升級篇-細(xì)胞培養(yǎng)8
35  當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低**少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。
36  一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
37  大部分添加物和試劑**多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。
 38  在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。
細(xì)胞分離試劑（1）
大部分連續(xù)細(xì)胞系，強貼壁細(xì)胞系，許多早代細(xì)胞：
HBSS或無鈣鎂PBS
0.25％胰蛋白酶溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中
細(xì)胞表面蛋白完整性重要的連續(xù)細(xì)胞系：
HBSS或無鈣鎂PBS
0.05％胰蛋白酶溶解在0.53mM EDTA
弱貼壁表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞（要求細(xì)胞表面完整性），原代細(xì)胞：
HBSS或無鈣鎂PBS
EDTA,甘油 溶解在檸檬酸鈉中
強貼壁早代細(xì)胞系：
HBSS或無鈣鎂PBS
0.25％胰蛋白酶溶解在1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在PBS
細(xì)胞分離試劑（2）
上皮細(xì)胞：
0.5mM -1mM EDTA
0.5mM -1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在PBS
強貼壁細(xì)胞，上皮細(xì)胞，一些腫瘤細(xì)胞：
0.5mM -1mM EDTA
0.25％胰蛋白酶1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂PBS
厚培養(yǎng)物，多層富含膠原的密集培養(yǎng)：
1mM EDTA
0.25％胰蛋白酶，200單位/ml膠原酶，1mM EDTA溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中
培養(yǎng)液pH 值變化太快：
CO₂ 張力不對。培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊。NaHCO₃ 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。培養(yǎng)液中鹽濃度不正確。細(xì)菌、酵母或真菌污染。
（1）按培養(yǎng)液中NaHCO₃ 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO₂ 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO₃ 對應(yīng)CO₂ 濃度為5％ 到10％。（2）改用不依賴CO₂ 培養(yǎng)液。
松開瓶蓋1/4 圈。
加HEPES 緩沖液**10 到25mM 終濃度。
在CO₂ 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。
丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。
培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變：
用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來。冰凍保存培養(yǎng)液。
用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后除菌。
將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。
培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀， 同時pH 發(fā)生變化：
細(xì)菌或真菌污染
丟棄培養(yǎng)物。或用抗生素除菌。
培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁：
胰蛋白酶消化過度。支原體污染。培養(yǎng)液中無貼壁因子。
縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。
分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。#p#分頁標(biāo)題#e#
懸浮細(xì)胞成簇：
培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子。支原體污染。蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解釋放DNA。
用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。
分離培養(yǎng)物，檢測支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
用DNase I 處理細(xì)胞。
原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染：
原代培養(yǎng)組織在進入培養(yǎng)前已污染
培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。
培養(yǎng)細(xì)胞死亡：
培養(yǎng)箱內(nèi)無CO₂。培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大。細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷。培養(yǎng)液滲透壓不正確。培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積。
檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO₂
檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度
取新的保存細(xì)胞種
檢測培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞能耐受滲透壓為260 – 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。
換入新鮮培養(yǎng)液
培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢：
由于更換不同培養(yǎng)液或血清。培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染。試劑保存不當(dāng)。
比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實驗。
增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度。
讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。
換入新鮮配制培養(yǎng)液。
補加谷氨酰胺或生長因子。
用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物。或用抗生素除菌。
血清需保存在-5℃ 到-20℃。培養(yǎng)液需在2－8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，并在2 周內(nèi)用完。
接種細(xì)胞起始濃度太低：
細(xì)胞已老化
支原體污染
增加接種細(xì)胞起始濃度。
換用新的保種細(xì)胞。
分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
血清 （1）
1. 保存血清**好的方法?
建議血清應(yīng)保存在-5℃**-2O℃。然而，若存放于4℃時，請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清**恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。
2. 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?
建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。
3. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?
血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但**普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝**無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。
4. 為什么要熱滅活血清?
加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。
血清（2）
5. 有必要做熱滅活嗎?
實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚**通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴增。
6. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀?
GIBICO的胎牛血清 沒有預(yù)老化，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在－20℃儲存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。
7. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?
解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20#p#分頁標(biāo)題#e#℃**4℃**室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃**37℃)，實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。
解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。
請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。
血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。
若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。
細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染情況總結(jié)如下:
常見的污染如下：
1、細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃，對細(xì)胞生長影響明顯。
仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時放氣時間足夠，壓力足夠！尤其是和儲存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲存液污染，一定要注意！下次使用前檢查一下培養(yǎng)液是否存在渾濁的現(xiàn)象！
可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理
2、霉菌：培養(yǎng)液是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質(zhì)，37度孵箱培養(yǎng)2-3天，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長，但時間長之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差，用硫酸銅溶液擦拭CO₂孵箱內(nèi)，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅。或者在培養(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。
CO₂孵箱被霉菌污染后，可把所有細(xì)胞暫時轉(zhuǎn)移，采用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個小時，使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后，再移入細(xì)胞。孵箱應(yīng)定期清潔（2月左右），尤其在多雨的季節(jié)。
其它培養(yǎng)箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。
預(yù) 防霉菌污染，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；但細(xì)胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補，建議 舍棄該污染細(xì)胞。，將環(huán)境徹底消毒，如果所有細(xì)胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培養(yǎng)基和器材，如果只是個別污染，可能是操作問題，就要注意操作
3、支原體：黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會渾濁，原體感染，G內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中**常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死去。
用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培養(yǎng)，無任何不良反應(yīng)。Sigma公司的使用時用50ug/ml Tylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。
4、黑蛟蟲：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細(xì)胞還是可以用的。 常常是細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細(xì)胞生長狀態(tài)不會 有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。
5、真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎 片分不清，慢慢的會長出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。
6、原蟲：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點狀物數(shù)量非常多，輕微活動，細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不 透亮。他們與細(xì)胞可共生但會與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會影響到細(xì)胞的正常生長，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量 時就會影響到細(xì)胞的生長，**終形成惡性循環(huán)。
污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒問題、操作問題、環(huán)境問題等等
關(guān)于培養(yǎng)基的無菌狀況，取培養(yǎng)基**培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞），37度試培養(yǎng)一段時間后觀察。如果沒有細(xì)菌生長 就是操作的問題。
也可以在培養(yǎng)基中事先加入雙抗（硫酸鏈霉素和氨芐青霉素）。但雙抗有時會影響細(xì)胞的狀態(tài)，所以在做轉(zhuǎn)染、檢測細(xì)胞某項指標(biāo)前一定要撤去雙抗，以避免影響實驗結(jié)果。
1、孵箱應(yīng)定期用三氧機消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時孵箱內(nèi)的水應(yīng)是三蒸水#p#分頁標(biāo)題#e#
2、超凈臺取材器材培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶操作等因素
3、超凈臺的風(fēng)機不能過大，風(fēng)機到6-8格。否則也可能能致霉菌污染
4、無菌室經(jīng)甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時即可進入操作。
以上均源自上相關(guān)貼子,然后加以總結(jié)希望對大家有用!!
 
關(guān)于“黑膠蟲”或“黑蛟蟲”或“黑焦蟲”的性質(zhì)或本質(zhì)，有誰能提供點資料么？比如生物學(xué)分類，生活習(xí)性，結(jié)構(gòu)形態(tài)，高倍鏡或電鏡圖片。另外，有英文相關(guān)文獻么？**少名字有英文的么？有人研究這種“蟲子”或“微生物”或“納米級細(xì)菌”么？
 
我們實驗室這段時間經(jīng)常污染。在低倍鏡下觀察，是很多黑色的小點，在 高倍鏡下，發(fā)現(xiàn)黑色小點在原地輕微的顫動，這是黑膠蟲嗎
 
我的細(xì)胞也懷疑是黑膠蟲污染,但是否經(jīng)空氣傳播?因為同一培養(yǎng)箱中有的細(xì)胞中,高倍鏡下可見小黑點游動,有的就沒有,且黑點會長成黑蟲
 
關(guān)于黑膠蟲：
根據(jù)平時的操作，我覺得“黑膠蟲”有沒有可能是以下操作細(xì)節(jié)方面的問題導(dǎo)致的呢？
1、有時候血清瓶或者培養(yǎng)瓶上用標(biāo)記筆寫的字沒有擦掉就直接泡酸，字跡溶解后沉積在酸缸中浸泡的瓶子里沖洗不凈。
2、過火的時候不小心碰到酒精燈的燈芯，粉塵飛進培養(yǎng)液內(nèi)。
3、有的同學(xué)習(xí)慣將移液管塞棉花的一端在酒精燈上焚燒一下，灰燼飛進培養(yǎng)液內(nèi)。
請教！
 
看貼后,我懷疑我的雜交瘤被霉菌污染了.
24孔板中央老是有絮狀物,細(xì)胞沒死,但生長不佳.將絮狀物吸出后,第二天又有.并且將細(xì)胞裹在里面生長.請問這樣的瘤細(xì)胞能不能上腹水.
 
我 培養(yǎng)基里都加了雙抗，剛開始一瓶腫瘤細(xì)胞狀態(tài)還好，但過了兩三天培養(yǎng)基里會出現(xiàn)很多一團團的東西飄著，瓶底還是有貼壁的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基混濁，開始以為是 細(xì)胞長得太多，導(dǎo)致接觸抑制死亡，但是倒掉培養(yǎng)基，用PBS洗干凈，把瓶內(nèi)貼壁的細(xì)胞用胰酶消化分裝后，第二天還是出現(xiàn)這種情況。有時如果傳代的細(xì)胞特別 少，每天給他換液，到了第三天左右，細(xì)胞數(shù)目不多，但也出現(xiàn)了上述的情況（很多碎片和團狀物飄著），不知大家有沒有遇到這種情況，幫忙分析分析。謝謝！ （我養(yǎng)的都是腫瘤細(xì)胞）
 
“黑膠蟲”=子虛烏有
 
污染后，培養(yǎng)液味道變臭了是什么污染。
 
zhyy_ping :
培養(yǎng)液味道變臭了應(yīng)該是厭養(yǎng)菌污染.
 
我 培養(yǎng)基里都加了雙抗，剛開始一瓶腫瘤細(xì)胞狀態(tài)還好，但過了兩三天培養(yǎng)基里會出現(xiàn)很多一團團的東西飄著，瓶底還是有貼壁的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基混濁，開始以為是 細(xì)胞長得太多，導(dǎo)致接觸抑制死亡，但是倒掉培養(yǎng)基，用PBS洗干凈，把瓶內(nèi)貼壁的細(xì)胞用胰酶消化分裝后，第二天還是出現(xiàn)這種情況。有時如果傳代的細(xì)胞特別 少，每天給他換液，到了第三天左右，細(xì)胞數(shù)目不多，但也出現(xiàn)了上述的情況（很多碎片和團狀物飄著），不知大家有沒有遇到這種情況，幫忙分析分析。我也有同 樣問題，
 
malone2001 wrote:
我培 養(yǎng)基里都加了雙抗，剛開始一瓶腫瘤細(xì)胞狀態(tài)還好，但過了兩三天培養(yǎng)基里會出現(xiàn)很多一團團的東西飄著，瓶底還是有貼壁的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基混濁，開始以為是細(xì) 胞長得太多，導(dǎo)致接觸抑制死亡，但是倒掉培養(yǎng)基，用PBS洗干凈，把瓶內(nèi)貼壁的細(xì)胞用胰酶消化分裝后，第二天還是出現(xiàn)這種情況。有時如果傳代的細(xì)胞特別 少，每天給他換液，到了第三天左右，細(xì)胞數(shù)目不多，但也出現(xiàn)了上述的情況（很多碎片和團狀物飄著），不知大家有沒有遇到這種情況，幫忙分析分析。我也有同 樣問題，
我現(xiàn)在也出現(xiàn)了類似的情況
有可能是支原體污染
 
曾經(jīng)做單抗鋪巨噬細(xì)胞，鋪好發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全是會動的，跑的還挺快！！仔細(xì)一看，全是滴蟲。感情這只老鼠感染了滴蟲！！！！我那個郁悶阿！
 
我的細(xì)胞污染探索
某 天打開孵箱，看到我的L1210的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)液又是黃黃的，覺得很不錯，今天又可以傳代了，可是在鏡下一看，細(xì)胞雖然明顯增加了，但并沒有象以前那樣長 滿，而且更讓我心驚的是怎么出現(xiàn)了許多黑色的小點，桿狀，而且好像在動來動去，翻轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)，在細(xì)胞很多的地方小點就少，而在細(xì)胞較少的地方小點就多，細(xì)胞 的活力也沒有以前好了，**反應(yīng)細(xì)菌污染，請實驗室老師過來看，說不是細(xì)菌污染，這個點要比細(xì)菌的小黑點大的多，也好象不是霉菌，沒有菌絲，沒有常見的團 壯的生長，肯定不對勁，但到底是什么，說不上來。**后，決定換液、洗滌、離心，換瓶，操作結(jié)束后鏡下看黑點幾乎看不到了，有點放下心來。
隔天后去 看，培養(yǎng)液還和上面的一樣，但鏡下，那種東西又出來了，在細(xì)胞少的地方，幾乎呈現(xiàn)出粗砂粒樣，我欲哭無淚，知道可能不行了，郁悶的換液后，回家上網(wǎng)·搜， 一個名詞跳了出來：黑膠蟲。黑色、桿狀、運動、細(xì)胞不會很快死亡，這些描述簡直驚人的一致，我確定了，我受到了黑膠蟲的襲擊。但黑膠蟲是什么，由于網(wǎng)上說 法不一，我決定探究一下。#p#分頁標(biāo)題#e#
 
這是我的探究過程：shou先，培養(yǎng)液略黃，稍有渾濁，鏡下觀察，細(xì)胞還沒有死，但是已經(jīng)不長了，那種東西已經(jīng)是鋪天蓋地了，滿眼望去，盡是粗砂粒樣，細(xì)胞好像成了一個個汪洋中的小島。
細(xì) 胞涂片，送到化驗室，革蘭氏染色，不久電話回報懷疑－－真菌。**反應(yīng)不可能，親自去了化驗室，看到了片上一個個瓜子樣的小點，染色呈黑色。看我還有些懷 疑，化驗室的同事又作了滴片，鏡下暗視野40倍可見一個個亮白色芝麻樣的東西在游來游去，再次涂片染色仍和以前一樣，并且可以見到芽孢樣的形狀，他們確定 無疑是真菌，但不是常見的念珠軍、霉菌，具體是什么，也說不上來。由于已經(jīng)蓋棺定論，計劃的HE染色、支原體沒有進行。
已經(jīng)將污染的細(xì)胞扔掉了。休整幾天。